Protocolo Desinfección - Gadesplant - Orquideas y Terrarios

📖 Capitulo II – ANEXO II

por

Guía de Prevención y Control de Contaminación en Cultivos In Vitro de Orquídeas, Protocolo TTC.

Tabla de Concentraciones de Tetrazolio para Viabilidad en Orquídeas

🧪 Tabla de Concentraciones de Tetrazolio para Viabilidad en Orquídeas

🌺 Protocolo TTC (Cloruro de 2,3,5-Trifenil Tetrazolio) para Orquídeas

📊 TABLA PRINCIPAL DE CONCENTRACIONES

Material Vegetal Concentración TTC Tiempo Incubación Temperatura pH Óptimo Condiciones
SEMILLAS MADURAS
Cattleya spp. 0.5-1.0% (w/v) 6-12 horas 25-30°C 6.8-7.2 Oscuridad total
Phalaenopsis spp. 0.3-0.7% (w/v) 4-8 horas 28-32°C 7.0-7.4 Oscuridad total
Dendrobium spp. 0.4-0.8% (w/v) 5-10 horas 26-28°C 6.5-7.0 Oscuridad total
Oncidium spp. 0.6-1.2% (w/v) 8-14 horas 24-27°C 6.8-7.3 Oscuridad total
Paphiopedilum spp. 0.8-1.5% (w/v) 12-18 horas 22-25°C 6.5-7.0 Oscuridad total
Vanda spp. 0.4-0.9% (w/v) 6-10 horas 28-30°C 7.0-7.5 Oscuridad total
Cymbidium spp. 0.7-1.3% (w/v) 10-16 horas 20-24°C 6.8-7.2 Oscuridad total
SEMILLAS INMADURAS
Cattleya (verdes) 0.2-0.4% (w/v) 3-6 horas 25-28°C 7.0-7.3 Oscuridad total
Phalaenopsis (verdes) 0.1-0.3% (w/v) 2-4 horas 28-30°C 7.2-7.5 Oscuridad total
Dendrobium (verdes) 0.2-0.5% (w/v) 4-7 horas 26-28°C 6.8-7.2 Oscuridad total
TEJIDOS VEGETATIVOS
Protocormos 0.1-0.3% (w/v) 2-4 horas 25-27°C 7.0-7.3 Luz difusa
Plántulas completas 0.2-0.4% (w/v) 3-6 horas 24-26°C 6.8-7.2 Luz difusa
Meristemos apicales 0.05-0.15% (w/v) 1-3 horas 25-27°C 7.0-7.4 Luz difusa
Explantes radiculares 0.3-0.6% (w/v) 4-8 horas 24-26°C 6.5-7.0 Oscuridad total
Pseudobulbos (secciones) 0.4-0.8% (w/v) 6-12 horas 22-25°C 6.8-7.2 Oscuridad total
Hojas (segmentos) 0.2-0.5% (w/v) 3-7 horas 24-27°C 6.8-7.3 Luz difusa

Criterios Específicos por Género

Cattleya spp.

  • Óptimo: Rojo intenso uniforme en todo el embrión
  • Aceptable: Rosa fuerte con gradiente hacia el centro
  • Dudoso: Coloración parcheada o irregular
  • Rechazar: Coloración solo en testa, embrión blanco

Phalaenopsis spp.

  • Óptimo: Rosa intenso homogéneo, embrión bien definido
  • Aceptable: Rosa medio con contornos claros
  • Dudoso: Coloración débil pero presente
  • Rechazar: Ausencia total de color en región embrionaria

Protocormos

  • Óptimo: Rosa uniforme en zona meristemática
  • Aceptable: Gradiente rosa desde ápice a base
  • Dudoso: Coloración irregular o en parches
  • Rechazar: Solo coloración superficial

🧬 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE TRABAJO

Solución Madre TTC (5% w/v)

• Cloruro de 2,3,5-Trifenil Tetrazolio: 5.0 g
• Agua destilada estéril: 100 mL
• Conservación: Refrigerado (4°C), máximo 1 semana
• Protección: Frasco ámbar (fotosensible)

Buffer Fosfato pH 7.0 (0.1 M)

• Na₂HPO₄ · 12H₂O: 3.58 g
• KH₂PO₄: 1.36 g
• Agua destilada: 1000 mL
• Ajustar pH con NaOH 0.1N o HCl 0.1N

Soluciones de Trabajo Específicas

Para Semillas Cattleya (Solución Estándar)

• Solución madre TTC 5%: 20 mL
• Buffer fosfato pH 7.0: 80 mL
• Concentración final: 1.0% TTC
• Volumen total: 100 mL
• Uso inmediato tras preparación

Para Semillas Phalaenopsis (Alta Sensibilidad)

• Solución madre TTC 5%: 14 mL
• Buffer fosfato pH 7.2: 86 mL
• Glucosa: 0.1 g (estimulante metabólico)
• Concentración final: 0.7% TTC

Para Protocormos (Ultra-Suave)

• Solución madre TTC 5%: 6 mL
• Buffer fosfato pH 7.1: 94 mL
• Manitol: 0.5 g (osmoprotector)
• Concentración final: 0.3% TTC

⏰ PROTOCOLOS TEMPORALES ESPECÍFICOS

Protocolo Rápido (Diagnóstico Urgente)

Material Concentración Tiempo Mínimo Indicadores Visuales
Semillas Phalaenopsis 0.8% 3 horas Rosa intenso = viable
Semillas Cattleya 1.0% 4 horas Rojo carmín = viable
Protocormos 0.4% 2 horas Rosa claro = viable

Protocolo Estándar (Análisis Rutinario)

Material Concentración Tiempo Óptimo Precisión Esperada
Semillas maduras 0.5-1.0% 8-12 horas 95-98%
Semillas inmaduras 0.2-0.4% 4-6 horas 90-95%
Tejidos vegetativos 0.1-0.5% 3-8 horas 92-97%

Protocolo Prolongado (Máxima Precisión)

Material Concentración Tiempo Extendido Aplicación
Semillas dormantes 0.3-0.6% 18-24 horas Investigación
Tejidos senescentes 0.8-1.2% 12-16 horas Análisis detallado
Embriones inmaduros 0.1-0.2% 6-10 horas Estudios específicos

🎨 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Escala de Coloración y Viabilidad

Coloración Observada Color % Viabilidad Interpretación
Rojo intenso/carmín 90-100% Altamente viable
Rosa fuerte 70-89% Viable
Rosa medio 50-69% Moderadamente viable
Rosa claro 30-49% Baja viabilidad
Rosa muy tenue 10-29% Muy baja viabilidad
Sin coloración/blanco 0-9% No viable

⚠️ FACTORES CRÍTICOS

Variables Críticas a Controlar

Factor Rango Óptimo Efecto si está Fuera del Rango
Temperatura ±2°C del óptimo Falsos negativos/positivos
pH de la solución ±0.3 unidades Reducción actividad enzimática
Tiempo de incubación ±15% del recomendado Sobre/sub-estimación viabilidad
Concentración TTC ±0.1% de la óptima Toxicidad o sensibilidad insuficiente
Luz durante incubación Oscuridad absoluta* Degradación del tetrazolio
Edad de la solución <24 horas Pérdida de actividad
*Excepción: Tejidos vegetativos que toleran luz difusa

🧪 CONTROLES DE CALIDAD

Controles Obligatorios

Control Positivo

  • Material: Semillas frescas de germinación conocida >90%
  • Tratamiento: Protocolo estándar para la especie
  • Resultado esperado: >85% coloración positiva
  • Frecuencia: Cada lote de análisis

Control Negativo

  • Material: Semillas tratadas con calor seco 80°C x 48h
  • Tratamiento: Mismo protocolo que muestras
  • Resultado esperado: <5% coloración
  • Frecuencia: Cada lote de análisis

Control de Reactivos

  • Test: Solución TTC + vitamina C (reductor)
  • Resultado esperado: Coloración roja inmediata
  • Interpretación: Confirma actividad del reactivo
  • Frecuencia: Cada nueva preparación

📋 TROUBLESHOOTING ESPECÍFICO

Problema Observado Causa Probable Solución Inmediata
Sin coloración en controles positivos TTC inactivo o pH incorrecto Preparar nueva solución, verificar pH
Coloración excesiva en negativos Contaminación bacteriana Esterilizar material, renovar solución
Coloración irregular en semillas Penetración insuficiente Aumentar tiempo, reducir concentración
Pérdida de color durante observación Exposición a luz Observar en condiciones de baja luminosidad
Coloración solo superficial Testa impermeable Pre-tratamiento con hipoclorito diluido
Variabilidad entre réplicas Heterogeneidad del lote Aumentar tamaño de muestra, homogeneizar

🔬 PROTOCOLOS AVANZADOS

Test de Viabilidad Diferencial (Embrión vs. Endospermo)

Para Semillas Grandes (Paphiopedilum, Cypripedium)

  1. Disección cuidadosa con microscopio estereoscópico
  2. Separación de embrión y endospermo
  3. Incubación individual en TTC 0.5%
  4. Evaluación independiente de cada estructura
  5. Documentación fotográfica a 40x

Test Cuantitativo con Espectrofotometría

• Extracción: Formazán en etanol 95%
• Lectura: 485 nm (absorbancia máxima)
• Cuantificación: Curva estándar con concentraciones conocidas
• Ventaja: Datos numéricos objetivos
• Aplicación: Investigación, control de calidad industrial
🎯 «La precisión en las pruebas de tetrazolio no depende solo de la concentración, sino de la comprensión integral de cada especie y la estandarización rigurosa del protocolo.»
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